近日，上海交通大學生命科學技術學院、微生物代謝國家重點實驗室鄧子新團隊合作于《自然通訊》（Nature Communications）雜志上發(fā)表題為 “聚酮合酶的碳-氮鍵形成”（C-N bond formation by a polyketide synthase）的研究論文。上海交大博士后王嘉良、上海佶凱星生物科技有限公司汪小杰、上海交大碩士李希希、國家蛋白質科學中心（上海）孔亮亮、上海交大碩士生杜澤乾和博士生李丹丹為該論文共同第一作者。上海交大林雙君教授、石婷研究員、鄧子新教授、汪志軍副研究員和梁晶丹副研究員為共同通訊作者。

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該工作通過組合分子遺傳學、結構生物學、生物化學和分子動力學模擬等多種技術手段，鑒定并重構鈣霉素合成途徑中聚酮合酶CalA3催化的C-N鍵形成現(xiàn)象，解析CalA3與底物、產(chǎn)物的高分辨復合物三維結構，深入推動次生代謝巨型蛋白質機器的生物化學與結構研究，為理解聚酮合酶新穎的C-N鍵形成機理、衍生新型藥物提供理論基礎。

聚酮合酶（PKSs）是自然界中一系列強大的多功能酶，能夠合成具有廣泛生物活性的天然產(chǎn)物，包括：抗生素，降膽固醇藥，抗腫瘤藥以及免疫抑制劑。由于其具有功能多樣、結構復雜等特點，探究PKSs的基本催化機制一直是微生物天然產(chǎn)物合成，進而衍生新型藥物的研究焦點之一。

通常情況下，聚酮合酶遵守著相同的基本合成原理：催化C-C鍵的形成。然而，在抗生素鈣霉素合成途徑的聚酮鏈釋放步驟，存在一種潛在的、未被鑒定的C-N鍵形成現(xiàn)象。關鍵的科學問題亟待進一步回答：（1）哪個酶負責催化C-N鍵的形成？該酶整體組織架構怎樣，與其家族成員有何異同？（2）經(jīng)典的形成C-C鍵的聚酮合酶如何催化C-N鍵的形成？（3）關鍵結構域、活性位點氨基酸如何進行底物的識別、縮合以及聚酮鏈終產(chǎn)物的釋放？

針對上述關鍵性問題，研究人員首先通過體內敲除實驗，論證了聚酮合酶CalA3負責催化鈣霉素聚酮鏈釋放步驟中C-N鍵的形成。隨后運用冷凍電子顯微鏡單顆粒分析技術，成功解析3.38 ?的CalA3高分辨結構（圖1）。CalA3整體呈現(xiàn)“∞”型的二體構架，分為上、下兩個部分。上半部分“結構區(qū)”，包含DH-KR（脫水酶-酮還原酶）結構域，下半部分“催化區(qū)”，包含DD-KS-AT（對接-酮脂酰合酶-乙酰轉移酶）結構域。

圖1. 聚酮合酶CalA3的整體構架

結構高度對稱的CalA3上、下兩個區(qū)域緊密相互作用，互作面積達到~2842   ?2（圖2）。DD結構域呈現(xiàn)水平、垂直的兩種截然不同的構象；AT、DH、KR結構域由于缺失活性位點氨基酸、或底物通道被堵塞、或輔因子結合序列丟失等原因，無法執(zhí)行其應有的功能。它們組成了一個分子量巨大的“蓋子”，以非酶促的方式起到穩(wěn)定整個蛋白質結構的作用。

圖2. 結構域間的相互作用以及非酶結構域的特征

CalA3真正的催化活性隱藏在KS結構域里（圖3）。通過體外重構成功鑒定了KS結構域催化聚酮鏈模擬底物SNAC-N1與輔因子3-HAA（三羥基鄰氨基苯甲酸）之間的縮合反應，核磁共振確定了形成C-N鍵或水解并被釋放的兩個終產(chǎn)物的化學結構；點突變測活鎖定了關鍵的活性位點氨基酸C197-H332-H372催化三聯(lián)體。

圖3. CalA3 KS結構域的結構與功能

為深入探究CalA3-KS的C-N鍵催化機制，通過分子動力學模擬對催化過程進行了初步的預測；運用冷凍電鏡進一步捕獲了CalA3與兩種終產(chǎn)物的高分辨復合物結構（圖4），最終揭示了CalA3-KS的精確催化機制：在聚酮鏈進入KS的底物通道后，C197對其硫酯鍵發(fā)動親核攻擊，形成酰化狀態(tài)。H332從輔因子3-HAA的氨基上獲取一個氫，作為廣義堿再次發(fā)動親核攻擊，最終形成C-N鍵并釋放終產(chǎn)物或通過水解反應釋放終產(chǎn)物。此外，在形成碳四面體中間產(chǎn)物時，H372、K367、L437和L439巧妙地穩(wěn)定了輔因子3-HAA，起定位作用。

圖4. CalA3 KS結構域的催化機制

CalA3緊致并高度對稱的整體構架與其家族的其他PKSs差異巨大。通過人工智能AlphaFold2預測了合成雷帕霉素、FK-506以及兩性霉素的16個PKSs的完整結構（圖5）。與CalA3相反，這些PKSs通過結構的動態(tài)搖擺、創(chuàng)造非對稱的催化腔體，實現(xiàn)上述免疫抑制劑和抗生素的生物合成。

圖5. CalA3與功能性聚酮合酶的構架對比及預測

綜上所述，研究人員解析了一個擁有罕見構架的聚酮合酶CalA3的完整結構，揭示CalA3催化的C-N鍵的形成機制。關鍵的“催化”氨基酸與“定位”氨基酸通力合作，實現(xiàn)新穎的C-N鍵的形成和終產(chǎn)物的釋放。CalA3與同家族PKSs的細致結構對比，則為工程化改造聚酮合酶，合成創(chuàng)新藥物提供重要的基礎理論依據(jù)。

華北理工大學副教授茍麗霞、上海交大博士吳昊、博士生曹衛(wèi)、博士后王曉政參與了該項工作。感謝國家蛋白質中心王芳芳、辛立輝、李光一、段佳琳、劉娜等老師的技術支持。感謝上海交通大學超算中心π 2.0集群提供的平臺及技術支持。

該研究得到了國家重點研究發(fā)展計劃、國家自然科學基金、國家博士后科學基金以及上海市超級博士后激勵計劃的經(jīng)費支持。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-36989-w

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